双酶切实验原理(双酶切实验原理示意图课件)

1-酶切技术的双酶切

本实验选择双酶切能保证酶的有效切割，双酶切该注意酶切顺序。在双酶切载体时2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。

双酶切反应 (Double Digests)同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。

原因是单酶切形成的粘性末端完全相同，就像拼图，除了内容不同，两边完全切合。所以结合方式过多，可能性也多，如质粒和目的基因正确连接，质粒和目的基因反转连接，质粒和质粒连接，目的基因与目的基因的连接。

实验材料准备 材料：质粒DNA。 试剂：限制性内切酶、ddH2O。3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。

常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。（1）单酶切法：这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。

2-请大侠赐教:什么时候用单酶切,什么时候用双酶切

单酶切：如果用同一种限制酶切割质粒和目的基因，会产生四个相同的黏性末端，那么可能会出现四个结果。（1）质粒和质粒连接（2）质粒和目的基因连接（3）目的基因和目的基因连接（4）质粒和目的基因环化。

第二次用双酶切切下目的基因，同时切的第二个载体是用于构建载体用的，双酶切后就将目的基因和用于构建的载体连接起来。

酶切法原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。

一般可以采用第一个酶酶切后割胶回收进行第二个酶的单酶切、直接双酶切两种 单酶切：一个一个切，第一次环变直线，第二次，直线变两段 双酶切：直接会有两段 还有一种，完全弥散，没条带，即酶量过了。

3-为什么要两种酶才能切割基因(两端要不同的限制酶),不能是同一种吗...

1、为了防止目的基因和运载体自身环化。为保证目的基因正序插入运载体，防止反向连接。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

2、目的基因的两端都要和质粒末端相匹配，切目的基因的限制酶也是那一个，就是一种限制酶。如果用两个限制酶切质粒的话，目的片段的两端分别是2种相匹配的，需要用2种限制酶切。就是总共2种限制酶。不存在标题的情况。

3、一般情况下是的，因为只有这样才能有相同的黏性末端，目的基因和运载体才能重组。但也有两种不同的内切酶产生相同的黏性末端如G↓ATTCG 和↓ATTC。

4、那么片段和质粒都有相同的粘性末端，在T4连接酶作用下是非常容易发生连接的。只不过有两种连接方向（这个你也可以理解吧。

5、具体分析如下：要获取目的基因，要在目的基因的两端切割，两端分别有限制酶1和限制酶2的切点，那么我们用两种不同的限制酶切割，这样目的基因的两端就会有不同的末端，就不会出现目的基因的环化。

4-单酶切和双酶切相比有何优缺点

原因是单酶切形成的粘性末端完全相同，就像拼图，除了内容不同，两边完全切合。所以结合方式过多，可能性也多，如质粒和目的基因正确连接，质粒和目的基因反转连接，质粒和质粒连接，目的基因与目的基因的连接。

我们再根据目的片段和质粒的实际长度对比切割后各自的长度得到我们的目的片段分布位置即可。右侧两个为质粒对照 注意事项：注意调整切割时间，尽量切割完全。电泳时设置对照实验。注意单酶切和双酶切位点的区分。

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。

可保证插入外源片段的方向，并且可以防止载体的自连，提高重组率。

5-本实验为什么选择双酶切?双酶切该注意什么?

同步双酶切选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。

为了防止目的基因和运载体自身环化。为保证目的基因正序插入运载体，防止反向连接。限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

本实验使用其中的Ⅱ型酶对DNA分子进行切割，并得到粘性末端或平末端。限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min，完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。

双酶切，试验中要注意 做转化的时候，进行酶连接反应时，需要注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时16度。

6-为什么要对重组质粒DNA进行双酶切

双酶切就是为了验证是否有目的基因，如果双酶切条带正确，而且PCR也没有问题，就可以确定质粒构建成功。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。

\验证重组质粒的构建是否成功，如果成功了，电泳应该是载体片断和插入序列两条条带，分别对应应有的长度。

补充一点就是看看你的片段是否有这个酶的酶切位点。尽管有些好笑，但是有人确实犯过这样的错误。你提取的质粒浓度很低的话，在酶切的时候就少加点水多加点质粒。不然浓度低当然看不见。

切割目的基因时同种序列当然可以用同种限制酶切割；但有时也用不同种的限制性酶割。用不同限制酶切割的目的是：保证目的基因和质粒（运载体）的准确连接，避免无效连接过多。

切割后能产生相同的黏性末端，末端彼此间可以发生碱基互补配对，从而形成重组DNA分子。所以当用两种不同限制酶也就是双酶切，分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，能够防止发生目的基因与质粒自身连接体，充分克服单酶切的缺点。

质粒切掉一段，DNA切掉一段，切下来的质粒和DNA能重组，一个切口那就是DNA单独切了一段，或者质粒单独切了一段，形成平末端的话会自身环化（自己首位相连了。